高速離心技術(shù)在生物學上應用

前言：離心技術(shù)在生物科學，特別是在生物化學和分子生物學研究領(lǐng)域，已得到十分廣泛的應用，每個生物化學和分子生物學實驗室都要裝備多種型式的離心機。離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。
基本的工作原理
當一個粒子（生物大分子或細胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“F”由下式定義，即：
F = m•a = m•ω2 r
a — 粒子旋轉(zhuǎn)的加速度， m — 沉降粒子的有效質(zhì)量，ω—粒子旋轉(zhuǎn)的角速度， r—粒子的旋轉(zhuǎn)半徑 cm 。
通常離心力常用地球引力的倍數(shù)來表示，因而稱為相對離心力 “ RCF ”?；蛘哂脭?shù)字乘“g”來表示，例如25000×g，則表示相對離心力為25000。相對離心力是指在離心場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”
（980cm/sec2），此時“RCF”相對離心力可用下式計算：
∴ RCF = 1.119×10－5×rpm2 r
rpm — revolutions per minute每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min
由上式可見，只要給出旋轉(zhuǎn)半徑r，則RCF和rpm之間可以相互換算。但是由于轉(zhuǎn)頭的形狀及結(jié)構(gòu)的差異，使每臺離心機的離心管，從管口至管底的各點與旋轉(zhuǎn)軸之間的距離是不一樣的，所以在計算是規(guī)定旋轉(zhuǎn)半徑均用平均半徑“ra v”代替：
ra v= r min＋rmax / 2
r的測量如下圖所示：
34º
rmin
旋轉(zhuǎn)軸 rav
rmax
一般情況下，低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示，高速離心時則以“g” 表示。計算顆粒的相對離心力時，應注意離心管與旋轉(zhuǎn)軸中心的距離“r”不同，即沉降顆粒在離心管中所處位置不同，則所受離心力也不同。因此在報告超離心條件時，通?？偸怯玫匦囊Φ谋稊?shù)“×g”代替每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)“rpm”，因為它可以真實地反映顆粒在離心管內(nèi)不同位置的離心力及其動態(tài)變化?？萍嘉墨I中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值（RCFa v），即離心管中點的離心力。
為便于進行轉(zhuǎn)速和相對離心力之間的換算，Dole 和Cotzias 利用RCF的計算公式，制作了轉(zhuǎn)速“rpm”、相對離心力“RCF”和旋轉(zhuǎn)半徑“r”三者關(guān)系的列線圖，圖式法比公式計算法方便（列線圖參見附錄）。換算時，先在r標尺上取已知的半徑和在rpm標尺上取已知的離心機轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點間劃一條直線，與圖中RCF標尺上的交叉點即為相應的相對離心力數(shù)值。注意，若已知的轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標尺的右邊，則應讀取RCF標尺右邊的數(shù)值，轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標尺左邊，則應讀取RCF標尺左邊的數(shù)值。

離心機的主要構(gòu)造和類型
離心機可分為工業(yè)用離心機和實驗用離心機。實驗用離心機又分為制備性離心機和分析性離心機，制備性離心機主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大，分析性離心機一般都帶有光學系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，依據(jù)待測物質(zhì)在離心場中的行為（用離心機中的光學系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測），能推斷物質(zhì)的純度、形狀和分子量等。分析性離心機都是超速離心機。
1. 制備性離心機可分為三類：
⑴ 普通離心機：zui大轉(zhuǎn)速6000 rpm左右，zui大相對離心力近6000×g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離，轉(zhuǎn)子有角式和外擺式，其轉(zhuǎn)速不能嚴格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅血球、酵母細胞等。這種離心機多用交流整流子電動機驅(qū)動，電機的碳刷易磨損，轉(zhuǎn)速是用電壓調(diào)壓器調(diào)節(jié)，起動電流大，速度升降不均勻，一般轉(zhuǎn)頭是置于一個硬質(zhì)鋼軸上，因此地平衡離心管及內(nèi)容物就極為重要，否則會損壞離心機。
⑵ 高速冷凍離心機：zui大轉(zhuǎn)速為20000～25000rpm（r/min），zui大相對離心力為89000×g，zui大容量可達3升，分離形式也是固液沉降分離，轉(zhuǎn)頭配有各種角式轉(zhuǎn)頭、蕩平式轉(zhuǎn)頭、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭和大容量連續(xù)流動式轉(zhuǎn)頭、一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在0～40C，轉(zhuǎn)速、溫度和時間都可以嚴格準確地控制，并有指針或數(shù)字顯示，通常用于微生物菌體、細胞碎片、大細胞器、硫銨沉淀和免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細胞器如核蛋白體或單個分子。
⑶ 超速離心機：轉(zhuǎn)速可達50000～80000 rpm，相對離心力zui大可達510000×g，zui的生產(chǎn)廠商有美國的貝克曼公司和日本的日立公司等，離心容量由幾十毫升至2升，分離的形式是差速沉降分離和密度梯度區(qū)帶分離，離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。超速離心機的出現(xiàn)，使生物科學的研究領(lǐng)域有了新的擴展，它能使過去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細胞器得到分級分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。
超速離心機主要由驅(qū)動和速度控制、溫度控制、真空系統(tǒng)和轉(zhuǎn)頭四部分組成。超速離心機的驅(qū)動裝置是由水冷或風冷電動機通過精密齒輪箱或皮帶變速，或直接用變頻感應電機驅(qū)動，并由微機進行控制，由于驅(qū)動軸的直徑較細，因而在旋轉(zhuǎn)時此細軸可有一定的彈性彎曲，以適應轉(zhuǎn)頭輕度的不平衡，而不致于引起震動或轉(zhuǎn)軸損傷，除速度控制系統(tǒng)外，還有一個過速保護系統(tǒng)，以防止轉(zhuǎn)速超過轉(zhuǎn)頭zui大規(guī)定轉(zhuǎn)速而引起轉(zhuǎn)頭的撕裂或爆炸，為此，離心腔用能承受此種爆炸的裝甲鋼板密閉。
溫度控制是由安裝在轉(zhuǎn)頭下面的紅外線射量感受器直接并連續(xù)監(jiān)測離心腔的溫度，以保證更準確更靈敏的溫度調(diào)控，這種紅外線溫控比高速離心機的熱電偶控制裝置更敏感，更準確。
超速離心機裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離心機的主要區(qū)別。離心機的速度在2000 rpm以下時，空氣與旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭之間的磨擦只產(chǎn)生少量的熱，速度超過20000 rpm時，由磨擦產(chǎn)生的熱量顯著增大，當速度在40000 rpm以上時，由磨擦產(chǎn)生的熱量就成為嚴重問題，為此，將離心腔密封，并由機械泵和擴散泵串聯(lián)工作的真空泵系統(tǒng)抽成真空，溫度的變化容易控制，磨擦力很小，這樣才能達到所需的超高轉(zhuǎn)速。
2. 轉(zhuǎn)頭：
⑴ 角式轉(zhuǎn)頭：角式轉(zhuǎn)頭是指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭。它是由一塊完整的金屬制成的，其上有4～12個裝離心管用的機制孔穴，即離心管腔，孔穴的中心軸與旋轉(zhuǎn)軸之間的角度在20～40度之間，角度越大沉降越結(jié)實，分離效果越好。這種轉(zhuǎn)頭的優(yōu)點是具有較大的容量，且重心低，運轉(zhuǎn)平衡，壽命較長，顆粒在沉降時先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)就會出現(xiàn)顆粒沉積，此現(xiàn)象稱為“壁效應”，壁效應容易使沉降顆粒受突然變速所產(chǎn)生的對流擾亂，影響分離效果。
⑵ 蕩平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個自由活動的吊桶（離心套管）構(gòu)成。當轉(zhuǎn)頭靜止時，吊桶垂直懸掛，當轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速達到每分鐘200到800轉(zhuǎn)時，吊桶蕩至水平位置，這種轉(zhuǎn)頭做密度梯度區(qū)帶離心，其優(yōu)點是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中，離心時被分離的樣品帶垂直于離心管縱軸，而不像角式轉(zhuǎn)頭中樣品沉淀物的界面與離心管成一定角度，因而有利于離心結(jié)束后由管內(nèi)分層取出已分離的各樣品帶。其缺點是顆粒沉降距離長，離心所需時間也長。

⑶ 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成，轉(zhuǎn)子桶中裝有十字型隔板裝置，把桶內(nèi)分隔成四個或多個扇形小室，隔板內(nèi)有導管，梯度液或樣品液從轉(zhuǎn)頭中央的進液管泵入，通過這些導管分布到轉(zhuǎn)子四周，轉(zhuǎn)頭內(nèi)的隔板可保持樣品帶和梯度介質(zhì)的穩(wěn)定。沉降的樣品顆粒在區(qū)帶轉(zhuǎn)頭中的沉降情況不同于角式和外擺式轉(zhuǎn)頭，在徑向的散射離心力作用下，顆粒的沉降距離不變，因此區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的“壁效應”極小，可以避免區(qū)帶和沉降顆粒的紊亂，分離效果好，而且還有轉(zhuǎn)速高，容量大，回收梯度容易和不影響分辨率的優(yōu)點，使超離心用于制備和工業(yè)生產(chǎn)成為可能。區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的缺點是樣品和介質(zhì)直接接觸轉(zhuǎn)頭，耐腐蝕要求高，操作復雜。
⑷ 垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂直放置，樣品顆粒的沉降距離zui短，離心所需時間也短，適合用于密度梯度區(qū)帶離心，離心結(jié)束后液面和樣品區(qū)帶要作九十度轉(zhuǎn)向，因而降速要慢。

⑸ 連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：可用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離，轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成，離心時樣品液由入口連續(xù)流入轉(zhuǎn)頭，在離心力作用下，懸浮顆粒沉降于轉(zhuǎn)子桶壁，上清液由出口流出。
3. 離心管：
離心管主要用塑料和不銹鋼制成，塑料離心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短。
不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學腐蝕。但用時也應避免接觸強腐蝕性的化學藥品，如強酸、強堿等。
塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴，倒置不漏液。管蓋有三種作用：
①防止樣品外泄。用于有放射性或強腐蝕性的樣品時，這點尤其重要。②防止樣
品揮發(fā)。③支持離心管，防止離心管變形。
4. 分析性離心機：
分析性離心機使用了特殊設計的轉(zhuǎn)頭和光學檢測系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程。從而確定其物理性質(zhì)。
分析性超速離心機的轉(zhuǎn)頭是橢圓形的，以避免應力集中于孔處。此轉(zhuǎn)頭通過一個有柔性的軸聯(lián)接到一個高速的驅(qū)動裝置上，轉(zhuǎn)頭在一個冷凍的和真空的腔中旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)頭上有2～6個裝離心杯的小室，離心杯是扇形石英的，可以上下透光，離心機中裝有一個光學系統(tǒng)，在整個離心期間都能通過紫外吸收或折射率的變化監(jiān)測離心杯中沉降著的物質(zhì)，在預定的期間可以拍攝沉降物質(zhì)的照片，在分析離心杯中物質(zhì)沉降情況時，在重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個折射的透鏡，結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照像底板上產(chǎn)生了一個“峰”，由于沉降不斷進行，界面向前推進，因此峰也移動，從峰移動的速度可以計算出樣品顆粒的沉降速度。
分析性超速離心機和主要特點就是能在短時間內(nèi)，用少量樣品就可以得到一些重要信息，能夠確定生物大分子是否存在，其大致的含量，計算生物大分子的沉降系數(shù)，結(jié)合界面擴散，估計分子的大小，檢測分子的不均一性及混合物中各組份的比例，測定生物大分子的分子量，還可以檢測生物大分子的構(gòu)象變化等。

制備性超速離心的分離方法：
1. 差速沉降離心法：
這是zui普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。
差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當以一定的離心力在一定的離心時間內(nèi)進行離心時，在離心管底部就會得到zui大和zui重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經(jīng)過2～3次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。
此法主要由于組織勻漿液中分離細胞器和病毒，其優(yōu)點是：操作簡易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。
2. 密度梯度區(qū)帶離心法（簡稱區(qū)帶離心法）：
區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。此法的優(yōu)點是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；③顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。
此法的缺點是：①離心時間較長；②需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液；③操作嚴格，不易掌握。
密度梯度區(qū)帶離心法又可分為兩種：
（1）差速區(qū)帶離心法：當不同的顆粒間存在沉降速度差時（不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差）。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法稱為差速區(qū)帶離心法。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒（20% 的沉降系數(shù)差或更少）或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)，與顆粒的密度無關(guān)，大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。
離心管先裝好密度梯度介質(zhì)溶液，樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上，離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，zui后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶，沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降zui快的大顆粒到達管底前結(jié)束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質(zhì)的密度。梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液，其zui大密度和濃度可達1.28 kg/cm3和60％。
此離心法的關(guān)鍵是選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和時間
（2）等密度區(qū)帶離心法：離心管中預先放置好梯度介質(zhì)，樣品加在梯度液面上，或樣品預先與梯度介質(zhì)溶液混合后裝入離心管，通過離心形成梯度，這就是預形成梯度和離心形成梯度的等密度區(qū)帶離心產(chǎn)生梯度的二種方式。
離心時，樣品的不同顆粒向上浮起，一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度離心法。體系到達平衡狀態(tài)后，再延長離心時間和提高轉(zhuǎn)速已無意義，處于等密度點上的樣品顆粒的區(qū)帶形狀和位置均不再受離心時間所影響，提高轉(zhuǎn)速可以縮短達到平衡的時間，離心所需時間以zui小顆粒到達等密度點（即平衡點）的時間為基準，有時長達數(shù)日。
等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒大小和形狀無關(guān)，但大小和形狀決定著達到平衡的速度、時間和區(qū)帶寬度。
等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕CSCl，其密度可達1.7 g/cm3。此法可分離核酸、亞細胞器等，也可以分離復合蛋白質(zhì)，但簡單蛋白質(zhì)不適用。
收集區(qū)帶的方法有許多種，例如：
（1） 用注射器和滴管由離心管上部吸出。
（2） 有針刺穿離心管底部滴出。
（3） 用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。
（4）用一根細管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)zui大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動部分收集器收集。

離心操作的注意事項
高速與超速離心機是生化實驗教學和生化科研的重要精密設備，因其轉(zhuǎn)速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴重事故，因此使用離心機時都必須嚴格遵守操作規(guī)程。
1. 使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時重量之差不得超過各個離心機說明書上所規(guī)定的范圍，每個離心機不同的轉(zhuǎn)頭有各自的允許差值，轉(zhuǎn)頭中不能裝載單數(shù)的管子，當轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。
2. 裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細檢查轉(zhuǎn)頭，及時清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機中須重點保護的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉(zhuǎn)頭長時間不用時，要涂上一層上光臘保護，嚴禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。
3. 若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應放置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預冷。
4. 離心過程中不得隨意離開，應隨時觀察離心機上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應立即停機檢查，及時排除故障。
5. 每個轉(zhuǎn)頭各有其zui高允許轉(zhuǎn)速和使用累積*，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。每一轉(zhuǎn)頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉(zhuǎn)頭的zui高使用*，則須按規(guī)定降速使用。